科研 | J Allergy Clin Immunol：研究者发现皮肤内自然杀伤T细胞参与特应性皮炎的皮肤过敏性炎症

点击蓝字↑↑↑“微科享”，轻松关注不迷路

编译：微科盟阿温，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读自然杀伤T细胞（NKT）是一种非常规的T细胞，它连接先天免疫和适应性免疫，NKT细胞与特应性皮炎（AD）的发生有关。我们的目的是研究NKT细胞在AD发展中的作用，特别是在皮肤中,通过整体转录组学和蛋白质组学分析，CXCR4及其同源配体CXCL12在人类AD皮肤中显著上调。CXCR4⁺ NKT细胞在AD小鼠皮肤中富集，并且在我们的AD小鼠模型中持续升高。过敏原诱导的NKT细胞参与皮肤过敏性炎症。主要的皮肤NKT细胞是CXCR4⁺和CD69⁺，类似于组织驻留记忆T（T_RM）细胞，皮肤NKT细胞特异性表达CXCR4；不同于肝、脾和淋巴结中的NKT细胞，皮肤成纤维细胞是CXCL12的主要来源。CXCR4⁺ NKT细胞优先运输到CXCL12富集区，形成富集的CXCR4⁺ NKT_RM/CXCL12⁺细胞簇，在我们的AD小鼠模型的急性和慢性过敏性炎症中发展。CXCR4⁺ NKT_RM细胞可能可以形成一个有助于特应性皮炎的生态位，其中CXCL12高表达。

论文ID

原名：Skin-resident natural killer T cells participate to cutaneous allergic inflammation in atopic dermatitis译名：皮肤内自然杀伤T细胞参与特应性皮炎的皮肤过敏性炎症
期刊：Journal of Allergy and Clinical Immunology
IF：10.228发表时间：2021.01通讯作者：Chang Ook Park
通讯作者单位：韩国延世大学医学院

实验设计

1. 采用串联质谱标记（TMT）方法进行定量蛋白质组分析，以确定TSLP激活NKT细胞的相关因素，且对AD和HC皮肤进行转录组学分析；

2. Transwell迁移分析确定CXCL12是否影响CXCR4⁺  NKT细胞的运输/迁移特性，进一步研究TSLP是否能诱导T细胞和成纤维细胞产生CXCL12；

3. 探讨在急性过敏性炎症小鼠模型中，表达CXCR4的NKT细胞与体内CXCL12⁺细胞的相互作用；然后在转移前用CSFE染色供体NKT细胞评估过敏原诱导的NKT细胞是否增殖；

4. 通过活体显微镜观察OVA治疗的耳朵中NKT细胞的迁移，以证明NKT细胞发生皮肤炎症；

5. CD45.1和CD45.2同源小鼠通过异种共生手术进一步验证皮肤NKT细胞的组织定植性；使用KAEDE小鼠进一步检测皮肤驻留和迁移NKT细胞之间CXCR4的不同表达；

6. 将CXCR4-flox和ZBTB16-GFP/Cre小鼠杂交产生子代，评估CXCR4在NKT细胞中的功能。

实验结果

1. AD皮肤中CXCR4⁺ NKT细胞/CXCL12增加
AD患者皮肤表皮强烈表达胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP），皮损中NK细胞增多。然而，NKT细胞是如何被招募到AD病变皮肤中的，TSLP是如何与NKT细胞相互作用迁移到AD皮肤中的机制尚不清楚。为了确定TSLP激活NKT细胞的相关因素，我们采用串联质谱标记（TMT）方法进行了新的定量蛋白质组分析。我们分别用TMT等压标记从未处理组、TSLP 6小时处理组和TSLP 24小时处理组NKT细胞中提取的蛋白质，然后用二维液相色谱-串联质谱（MS/MS）分析（图E1A）。最初，我们在TSLP处理和未处理的NKT细胞中鉴定了1404种蛋白质，并进行了基因本体（GO）分析（图E1B）。在24个被认为是差异表达的蛋白质中（高斯拟合比≤-0.37或≥0.37），只有CXCR4被发现以时间依赖的方式逐渐上调（图1A）。与血液相比，TSLP有助于AD皮肤形成独特的微环境；因此，我们进一步分析了AD患者和健康对照组（HCs）的皮肤和血液T细胞的整体转录组。层次聚类显示，在AD皮肤和HC皮肤之间，分化基因的大偏移量在转录上是唯一的（图1B）。主成分分析还显示，AD皮肤（红色）和HC皮肤（蓝色）形成两个不同的簇，而AD患者和HCs的外周血T细胞分化较差，形成一个单一簇（绿色）（图1C）。与AD患者外周血相比，病变皮肤中Vα24Jα18⁺NKT细胞数量增加（图1D）。我们还检测到AD皮肤中Vα24Jα18+NKT细胞的频率高于HC皮肤（图1E）。有趣的是，皮肤上的NKT细胞比AD患者血液中的NKT细胞表达更高的CXCR4水平（图1F）。与HC皮肤相比，CXCR4⁺ NKT细胞浸润AD皮肤的数量要多得多（图1G和H）。对AD和HC皮肤的进一步转录组学分析表明，CXCR4的同源配体CXCL12在AD皮肤中显著升高，与其他趋化因子基因CCL17、CCL18以及其他AD相关基因包括S100A7、S100A8和S100A9一起升高（图1I和图E1C）。我们的转录组学数据与之前在AD皮肤中观察到的下调和上调基因的研究结果一致（图1J）。综上所述，这些数据表明，在AD皮肤中，CXCR4⁺ Vα24Jα18+NKT细胞和CXCL12显著增加，暗示CXCR4/CXCL12轴参与了NKT细胞向AD皮肤的募集。图1 AD患者皮损中CXCR4⁺ NKT细胞增多
（A）实验方案。AD患者和健康对照组（HC）的微阵列（B）和点图（C）分析。AD-PBMCs和AD皮肤中NKT细胞的代表性群体（D）和CXCR4表达（F）。（E）NK细胞在HC和AD患者外周血单个核细胞和皮肤中的定量分布。AD和HC皮肤中CXCR4⁺NKT细胞的免疫荧光染色（G）和定量（H）。散点图（I）和热图（J）显示AD和HC皮肤中上调和下调的选定基因。 2. CXCL12在TSLP激活的成纤维细胞和T细胞中的表达
由于皮肤NKT细胞表达高水平的CXCR4，我们研究了Vα24Jα18⁺NKT细胞如何与CXCL12相互作用，并且两者相互作用在AD皮肤中显著升高。我们发现Vα24Jα18⁺NKT细胞不表达CXCL12；然而，皮肤NKT细胞与其他产生CXCL12的细胞并列，表明CXCR4⁺ Vα24Jα18⁺NKT细胞可能直接与周围产生CXCL12的细胞相互作用（图E2A）。接下来我们观察到，在AD皮肤中产生CXCL12的细胞呈现出细长和圆形两种形状，因此，我们用抗波形蛋白和抗CD3抗体对这些细胞进行染色，以区分真皮成纤维细胞和T细胞。与HC皮肤相比，我们在AD皮肤的成纤维细胞（图E2B）和T细胞（图E2D）中观察到CXCL12大量产生。皮肤成纤维细胞表达CXCL12的百分比（图E2C）高于T细胞，尽管两者在AD皮肤中都产生CXCL12（图E2E）。我们进一步研究了TSLP是否能诱导T细胞和成纤维细胞产生CXCL12，因为T细胞和成纤维细胞都有TSLP受体。TSLP激活的T细胞比未激活的T细胞产生更多的CXCL12（图E3A和B），并且TSLP 24小时处理组大量产生胞外（分泌型）CXCL12（图E3C）。此外，与未治疗组相比，TSLP治疗24小时后，成纤维细胞在细胞内和细胞外产生更多的CXCL12（图E3D）。为了确定CXCL12是否影响CXCR4⁺ NKT细胞的运输/迁移特性，我们进行了Transwell迁移分析。从人外周血单个核细胞（PBMC）中分离NKT细胞和T细胞，并用TSLP预处理24小时，暴露于CXCL12后，与CXCL12未处理的NKT细胞相比，NKT细胞迁移显著增加，而不是T细胞（图E3E），暗示表达CXCR4的NKT细胞可能迁移到AD皮肤富含CXCL12的区域。 3. 急性过敏性炎症小鼠的CXCR4⁺ NKT和CXCR12⁺细胞
接下来，我们进一步探讨了在急性过敏性炎症小鼠模型中，表达CXCR4的NKT细胞与体内CXCL12⁺细胞的相互作用。CXCL12-DsRed转基因小鼠在耳朵激发前5天在腹部用二硝基氟苯（DNFB）致敏（图2A）。我们观察到，只有接受DNFB致敏和用DNFB治疗的小鼠出现显著的耳肿胀，而用异硫氰酸荧光素（FITC）激发的DNFB致敏小鼠没有出现耳肿胀（图2B）。此外，为了证实过敏原诱导的NKT细胞特异性地发生皮肤过敏性炎症，我们采用NKT细胞的不同纯化策略，将DNFB或恶唑酮（OXA）致敏的TCRβ⁺/α-GalcerCD1d⁺ NKT细胞转移到Rag1^-/-（T和B细胞缺陷）受体中，并与不同的过敏原交叉激发。我们观察到，只有接受DNFB或OXA致敏NKTs并受到相应过敏原刺激的受者才会发生耳炎，否则对未经历过的过敏原无效（图E4）。总之，这些结果表明，这些NKT细胞，其中有经验的抗原记忆，可能引发皮肤过敏性炎症。此外，与野生型小鼠相比，Jα18^-/-NKT缺陷小鼠在用DNFB治疗后表现出较少的耳肿胀（图E5A和B），突出了NKT细胞在急性过敏性炎症中的作用。在DNFB诱发后6至72小时可以诱导CXCL12-DsRed细胞（图2C）。我们发现，在DNFB治疗后72小时，CXCL12⁺细胞被显著诱导（图2D），主要表达CXCL12的细胞是真皮成纤维细胞（图2E）以及CXCL12⁺CD3 T细胞，它们也显著增加（图2F），这与我们对人类AD皮肤的研究结果一致。我们还观察到，CXCL12⁺成纤维细胞和T细胞聚集并富集在DNFB治疗皮肤的同一部位，表明两种CXCL12⁺细胞同时与表达CXCR4的NKT细胞相互作用（图2G）。接下来我们检测了在DNFB治疗的皮肤中是否可以检测到CXCR4⁺NKT细胞。在DNFB治疗后第3天，DNFB处理的皮肤中NKT细胞的数量大量增加，但我们观察到，与DNFB未处理的小鼠相比，DNFB处理的淋巴结（LN）中NKT细胞的数量仅略有增加（图2H）。DNFB刺激皮肤中的NKT细胞表达CXCR4的水平显著高于LN（图2I），这与我们在人类中的结果一致。这些表达CXCR4的NKT细胞在DNFB治疗的皮肤中产生大量的IL-4、IFN-γ和IL-17（图E5C），这表明了在我们的模型中皮肤驻留NKT细胞的致病作用。为了验证NKT细胞在急性过敏性炎症中的致病作用，我们将DNFB致敏的脾NKT细胞（5×10⁵）（图E6A）转移到幼小的受体小鼠（CXCL12-DsRed）（图E6B）中。在转移后24小时，用DNFB治疗受体小鼠的右耳，同时在左耳进行空白对照治疗，然后在不同时间（12、24、48和72小时）测量耳肿胀量（图E6C）。我们观察到，接受DNFB致敏NKT细胞并用DNFB处理的受体小鼠与阳性对照小鼠（致敏，然后用DNFB治疗）相比显示出显著的耳肿胀。未经激发的DNFB致敏小鼠、未经激发的DNFB致敏小鼠或接受未经激发的DNFB致敏NKT细胞的受体小鼠均无反应。这些结果表明，在我们的急性过敏性小鼠模型中，过敏原诱导的NKT细胞可引起皮肤炎症。为了进一步评估过敏原诱导的NKT细胞是否增殖，我们在转移前用CSFE染色供体NKT细胞（图E6B）。我们发现转移的DNFB致敏NKT细胞在DNFB治疗后第1天迅速迁移到皮肤中，并且与没有DNFB治疗的细胞相比在第3天发生大量增殖（图E6D）。有趣的是，皮肤引流性LN（dLN）中DNFB致敏的NKT细胞在第1天开始增殖，即使没有DNFB治疗，在第3天也完全增殖（有或没有DNFB治疗），而非引流性LN（非dLN）中DNFB致敏的NKT细胞增殖最小。这些结果表明，DNFB诱导的NKT细胞具有皮肤归巢特性，即使没有二次治疗，也能维持至少10天的增殖潜能。我们接着观察到，与未激发的皮肤相比，在DNFB治疗的皮肤中，表达CXCR4的NKT细胞被时间依赖性地显著诱导（图E6E），这表明CXCR4⁺ NKT细胞浸润到急性过敏性皮肤中可以通过二次DNFB治疗以时间依赖性的方式被加速。为了解决急性过敏性炎症中过敏原诱导的NKT细胞如何在体内转移到皮肤，我们将GFP⁺ DNFB致敏的NKT细胞转移到CXCL12-DsRed受体中，然后用DNFB治疗（图E7A）。通过DNFB治疗后6小时的活体显像，NKT细胞渗入皮肤（图E7B）并以高速随机迁移（图E6E和F以及视频E1），此时NKT细胞中未诱导CXCR4表达。在DNFB治疗后24小时，我们观察到GFP⁺ NKT细胞显示出降低的运动性并开始定位于CXCL12-DsRed+细胞（图E7E和F以及视频E2）。在72小时，GFP⁺ NKT细胞表现出更大的运动性降低和更大的迁移限制性，进而驻留在CXCL12丰富的区域，随后形成一个绿红色的细胞簇（图E7B和E、F以及视频E3），显示GFP⁺ NKT细胞与表达CXCL12的成纤维细胞和T细胞聚集的独特模式（图E7C）。我们还发现GFP⁺ NKT细胞以时间依赖性的方式渗入皮肤（图E7D）；在72小时，GFP⁺ NKT细胞表达CXCR4，而LNs中的NKT细胞不表达CXCR4（图E7G）。总之，我们的结果表明，表达CXCR4的NKT细胞向富含CXCL12的区域流动，并形成CXCR4⁺ NKT/CXCL12⁺细胞簇，与急性过敏性炎症有关。 图2 CXCR4⁺ NKT和CXCR12⁺细胞在急性过敏性炎症小鼠中的表达
（A）实验方案。（B）DNFB诱导CXCL12-DsRed小鼠皮肤过敏性炎症。（C）DNFB治疗后6、24和72小时CXCL12 DsRed小鼠耳的活体内代表性图像。（D）CXCL12在有或无DNFB刺激72小时的耳皮肤细胞中的表达。在有或无DNFB刺激72小时的CXCL12表达耳皮肤细胞中成纤维细胞和CD3 T细胞的频率（E）和数量（F）（**p<0.001）。（G）DNFB未处理的正常小鼠（NL）和DNFB治疗耳部皮肤72h的IF染色。NL和DNFB治疗小鼠皮肤和LN中CD3⁺和NK1.1⁺ NKT细胞的比例。（I）DNFB治疗小鼠LN和皮肤中CD3⁺和NK1.1⁺ NKT细胞CXCR4的表达。 4. 变应原诱导的NKT细胞介导AD小鼠模型的皮肤炎症
接下来，为了研究过敏原诱导的NKT细胞在慢性AD小鼠模型中的致病作用，我们在卵清蛋白（OVA）加霍乱毒素（CT）治疗前24小时将OVA致敏的GFP⁺ NKT细胞（5×10⁵）转移到幼小的B6野生型（WT）小鼠体内（图3A）。受试者在第7天表现出实质性的耳肿胀，与OVA致敏和激发的阳性对照组相当，而未经激发而给予OVA致敏NKT细胞的受试者或仅给予OVA致敏的小鼠没有反应（图3B），这表明慢性过敏原暴露诱导的NKT细胞也没有介导AD小鼠模型的皮肤炎症。为了排除常规T细胞的影响，我们进行了相同的过程，但将OVA致敏的NKT细胞转移到Rag1^-/-受体。我们的数据显示，在缺乏适应性免疫的情况下，NKT细胞介导了OVA诱导的皮肤炎症，但与图3B所示结果相比，皮肤炎症的强度较低（图E8），表明内源性常规T细胞也参与了OVA诱导的皮肤炎症（图3B；图E8）。通过活体显微镜观察，我们在第1天OVA治疗的耳朵中发现了缓慢迁移的NKT细胞（视频E4）。在第7天，我们观察到，与未受OVA治疗的耳朵（仅CT）相比，大量GFP⁺ NKT细胞迁移到OVA治疗的耳朵中（图3C和D）；GFP+NKT细胞簇是固着的并且显示出受限的运动性，这表明OVA诱导的NKT细胞也可以形成簇（视频E5），这与我们对急性过敏性炎症的研究结果一致。我们还发现，OVA诱导的NKT细胞在OVA治疗的皮肤中比在未治疗的皮肤中表达更多的CXCR4（图3E）。这些表达CXCR4的NKT细胞产生的IL-4和IFN-γ水平显著高于CXCR4^- NKT细胞（图3F-I），支持慢性诱导的皮肤驻留NKT细胞促进慢性AD的发展。 图3 在慢性AD小鼠模型中，NKT细胞发生皮肤炎症
（A）实验方案。（B）接受者耳肿胀。（C）在第7天有或没有卵黄刺激的情况下，位于耳内的GFP⁺ NKT细胞的代表性活体内图像。细胞计数（D）、CXCR4（E）、IL-4（F）和IFN-γ（G）在第7天接受或不接受OVA刺激的耳中表达GFP⁺ NKT细胞。第7天OVA刺激的皮肤CXCR4⁺和CXCR4-GFP⁺NKT细胞中IL-4（H）和IFN-γ（I）的数量。 5. 皮肤内NKT细胞表达CXCR4和CD69类似于T_RM细胞
我们对皮肤和血液转录组的结果显示了皮肤和血液T细胞之间的差异（图1C），我们的小鼠模型显示皮肤中NKT细胞中CXCR4的表达与LN相比存在差异。为了进一步评价这些结果，我们比较了正常WT B6小鼠皮肤、肝脏、LN和脾脏中NKT细胞的表型。我们发现肝脏中CD3⁺ NK1.1⁺NKT细胞或CD1d限制性NKT细胞的数量最高，其次是皮肤、脾脏和LN（图4A和图E9A）。当我们测量NKT细胞中CXCR4的表达时，只有皮肤NKT细胞表达CXCR4（图4A和图E9B和C）。相反，NKT细胞的另一个标记物CXCR6在包括肝脏和皮肤在内的所有组织中高表达，但不是皮肤特异性的（图E9D），表明CXCR4可能是皮肤驻留NKT细胞的特异性标记物。我们还证实了NKT细胞的两种纯化策略，并且CD3⁺ NK1.1⁺NKT细胞和TCRβ⁺ α-GalcerCD1d⁺ NKT细胞之间没有显著差异（图E10A和B）。近年来，许多不同类型的组织驻留记忆（T_RM）T细胞被发现，包括皮肤驻留T细胞和γδT细胞。因此，我们评估了CD69在不同组织的NKT细胞中的表达，CD69是T_RM的一个广受欢迎的标记物。CD69⁺ NKT细胞在肝脏和皮肤中最为丰富，其次是脾脏和LN（图4A）。在正常小鼠皮肤中，主要的NKT细胞是CD69⁺，所有表达CXCR4的NKT细胞也是CD69⁺（图4A），表明表达CXCR4的NKT细胞代表皮肤中的一种T_RM。与我们的小鼠结果一致，我们观察到，与HC皮肤相比，人类AD皮肤中可以鉴定出CXCR4⁺ CD69⁺Vα24Jα18⁺NKT细胞（图4B和C），并且皮肤驻留NKT细胞表达的CD69水平高于AD患者的循环NKT细胞（图4D）。这表明CXCR4⁺ CD69⁺NKT细胞是一种T_RM，通过在人AD皮肤中形成富集NKT细胞的簇而促进AD的发展（图4B）。为了进一步验证皮肤NKT细胞的组织驻留性，我们对CD45.1和CD45.2同源小鼠上进行了异种共生手术。在这种情况下，再循环细胞在每一个异种共生体之间平衡，而组织驻留细胞则不平衡（图4E）。术后4周，我们观察到大量LN白细胞嵌合体，而皮肤和肝脏的CD45⁺细胞在每个异种共生体之间失衡（图4F）。对于NKT细胞而言，肝脏中NKT细胞的剧烈不平衡被维持，并且我们在皮肤中观察到更多的CD45.2+组织驻留NKT细胞，而LN中CD45.1⁺或CD45.2⁺来源的NKT细胞以相似的比率存在（图4G）。宿主组织驻留在肝脏的NKT细胞表达的CD69水平高于从伴侣处迁移过来的NKT细胞（图4H）。与移行性NKT细胞相比，驻留于皮肤的NKT细胞也表达更高水平的CD69，而来自宿主和伴侣的LN-NKT细胞显示低水平的CD69。此外，皮肤驻留NKT细胞表达的CXCR4水平高于迁移的NKT细胞（图4H），支持CXCR4⁺ CD69⁺NKT细胞在皮肤中的组织驻留。 图4 皮肤内NKT细胞表达CXCR4和CD69
（A）皮肤、肝脏、LN和脾脏中CD3和NK1.1双阳性NKT细胞的频率（上升）及其CXCR4和CD69的表达（下降）。（B）CXCR4和CD69在人HC和AD皮肤Vα24Jα18⁺NKT细胞中的表达。（C）HC和AD患者皮肤中CXCR4⁺ CD69⁺NKT细胞的百分比。（D）CD69在AD患者皮肤及PBMC-NKT细胞中的表达。（E）异种共生手术实验方案。CD45.1和CD45.2同源小鼠通过异种共生手术连接。（F）第4周时，CD45.2宿主小鼠的皮肤、肝脏和LN中分布着CD45.1⁺/CD45.2⁺细胞。（G）皮肤、肝脏和淋巴结中CD45.1⁺/CD45.2⁺CD3⁺ NK1.1⁺ NKT细胞的频率。（H）CXCR4和CD69表达的CD45.1⁺/CD45.2⁺CD3⁺ NK1.1⁺ NKT细胞来自皮肤、肝脏和LN的CD45.2异种共生体。 为了进一步检测皮肤驻留和迁移NKT细胞之间CXCR4的不同表达，我们使用了KAEDE小鼠，该小鼠含有一种可光转换的绿色荧光蛋白，在紫外光照射下不可逆地改变为红色。暴露后，所有KAEDE+皮肤细胞立即变红（图5A和B以及视频E6和E7）。在暴露后24小时，我们在光转化的耳朵中发现了一个快速移动的KAEDE绿色细胞群，表明它们最近进入皮肤（图5A和B，以及视频E8）。与这些结果一致，我们观察到KAEDE红NKT细胞比KAEDE绿NKT细胞表达更高水平的CD69和CXCR4（图5C和D），证实了非迁移性CXCR4⁺ CD69⁺KAEDE红NKT细胞是皮肤中的一种T_RM细胞。为了描述皮肤NKT细胞的迁移模式，我们通过皮内注射（一半）和静脉注射（一半）将DNFB致敏的KAEDE NKT细胞转移到B6小鼠体内（图5E），立即将耳朵暴露于紫外光下，然后6小时后用DNFB治疗（图5E）。在紫外光照射后24小时，我们在DNFB治疗的耳朵中发现了KAEDE红色和绿色NKT细胞（图6F），支持最近从循环中招募的KAEDE绿色NKT细胞。此外，大多数KAEDE红NKT细胞是固定的，而KAEDE绿NKT细胞是可移动的（图5G和H以及视频E9）。与我们的上述数据一致，大多数KAEDE红NKT细胞保留高CXCR4，这是一种与皮肤驻留NKT细胞相关的表型，与表达低水平CXCR4的KAEDE绿NKT细胞不同，CXCR4是一种皮肤迁移NKT细胞的表型（图5I）。 图5 KAEDE小鼠光转化后的皮肤常驻NKT细胞
（A）紫外光照射后KAEDE小鼠耳廓在指定时间的活体图像。（B）在指定的时间，KAEDE红和绿CD3⁺ NK1.1⁺ NKT细胞的比例。（C）红、绿NKT细胞中CXCR4和CD69的表达。（D）红、绿NKT细胞中CD69⁺和CXCR4⁺ NKT细胞的相对百分比。（E）实验方案。（F）紫外光照射后24小时耳廓的活体图像。紫外光照射后24h，DNFB刺激耳中KAEDE红、绿NKT细胞的平均速度（G）和阻滞系数（H）。（I）红、绿NKT细胞中CXCR4的表达。 6. CXCR4缺陷的NKT细胞不能介导皮肤过敏性炎症
为了评估CXCR4在NKT细胞中的功能，我们将CXCR4-flox和ZBTB16-GFP/Cre小鼠杂交产生子代（CXCR4^fl/fl-ZBTB16^cre/+），其中CXCR4基因在NKT细胞中被选择性删除（CXCR4-KO）（图6A和B）。接下来，我们从CXCR4fl/fl（对照组）和CXCR4^fl/fl-ZBTB16^cre/+（CXCR4 KO）小鼠中分选DNFB致敏的脾NKT细胞，并在CFSE染色后将这些NKT细胞转移到CXCR12-DsRed受体中（图6A）。我们观察到，与WT对照组相比，给予DNFB致敏的CXCR4-KONKT细胞的受试者在DNFB治疗后12小时到72小时内没有出现耳肿胀（图6C），我们还发现CXCR4缺陷的NKT细胞在DNFB治疗的耳朵中的渗透能力显著受损（图6D），而大量的WT NKT细胞（绿色）位于CXCL12富集区（红色），在第3天DNFB治疗的耳朵中形成富集的绿-红簇（图6D和E）。我们证实，CXCR4⁺ NKT细胞迁移到接受WT NKT细胞的受试者DNFB治疗的皮肤中（图6F），但正如预期的那样，在给予DNFB致敏的CXCR4缺失细胞的CXCR4 KO组中，大多数皮肤NKT细胞不表达CXCR4（图6F和G）。与CXCR4缺陷NKT细胞相比，对照组DNFB治疗皮肤中的WT NKT细胞产生的IFN-γ水平显著更高（图6H）。此外，在WT对照组中，CXCR4⁺ NKT细胞是IFN-γ的主要产生者，而CXCR4^- NKT细胞在DNFB治疗的皮肤中产生非常低水平的IFN-γ（图6I），充分说明表达皮肤NKT细胞的CXCR4在AD皮肤炎症诱导中的致病作用。图6 CXCR4⁺ NKT细胞发生皮肤过敏性炎症
（A）实验方案。（B）对照组和CXCR4小鼠脾NKT细胞的RT-PCR结果。（C）CXCL12-DsRed受体在指定时间的耳肿胀。DNFB治疗72小时后，对照组NKT细胞和CXCR4-KO-NKT细胞的代表性活体内图像（D）和细胞计数（E）。转移的对照组和CXCR4-KO-NKT细胞在皮肤中的表达（F）和百分比（G）以及IFN-γ表达（H）。（I）转移对照NKT细胞中CXCR4⁺和CXCR4^- NKT细胞的IFN-γ表达。 

讨论

CXCR4是一种包含7-跨膜结构域和G-蛋白偶联的细胞表面受体，最初被鉴定为嗜T细胞（X4）HIV病毒进入CD4 T细胞的共受体。据报道，CXCR4在器官发育、肿瘤转移和免疫细胞运输中起重要作用。虽然CXCR4介导的NK细胞趋化性已有报道，但我们的蛋白质组学数据表明TSLP诱导NKT细胞表达CXCR4，暗示CXCR4介导的NKT细胞向富含TSLP的AD皮肤转运的可能机制。我们证明CXCR4⁺  NKT细胞浸润AD皮肤的数量比正常人皮肤的数量多。有趣的是，与AD皮肤NKT细胞相比，AD患者循环NKT细胞表达的CXCR4水平较低（图1F），表明CXCR4⁺ NKT细胞在过敏性炎症中具有皮肤特异性作用。此外，在异种共生手术研究和KAEDE小鼠中，CXCR4⁺ NKT细胞也表达CD69⁺，这是皮肤中T_RM的公认标记，证实了CXCR4⁺ NKT_RM细胞在皮肤中的特殊作用。炎症性皮肤病中致病性T细胞向受影响皮肤的迁移是AD皮肤表现发展过程中的一个关键事件。T细胞向炎症皮肤的转运已被广泛研究，皮肤淋巴细胞抗原和CCR4是皮肤归巢T细胞所必需的。然而，与传统的T细胞相比，NKT细胞在皮肤中的迁移特性尚未得到全面的评价。人NKT细胞具有不同的迁移特性，这取决于其解剖位置和疾病状态。肝脏NKT细胞高表达CXCR6并对CXCL16产生反应，在肝脏中积聚，提供免疫监视、抗肿瘤活性或促进炎症和肝纤维化的作用。在小鼠模型中，表达CXCR6的肾NKT细胞也能减轻严重肾炎。CXCR6也在皮肤NKT细胞中表达，但包括肝脏、LN和脾脏在内的所有组织中的NKT细胞都表达高水平的CXCR6；因此，CXCR6的表达是NKT的一个普遍特性，不是皮肤特异性的。相反，我们发现CXCR4⁺ NKT细胞主要存在于皮肤中，很少出现在肝脏、LN和脾脏中。值得注意的是，肝脏、LN和脾脏中的所有NKT细胞都是CXCR4^-。此外，转移过敏原诱导的NKT细胞后，CXCR4⁺ NKT细胞优先迁移到皮肤而不是肝脏、LN或脾脏。此外，KAEDE光转化研究表明，KAEDE红皮NKT细胞表达CXCR4的水平高于迁移的KAEDE绿NKT细胞。这表明CXCR4是NKT_RM的皮肤特异性趋化因子受体，它通过诱导NKT细胞浸润到炎症的富含CXCL12的AD皮肤中而参与致病事件。CXCL12是CXCR4的同源配体，在包括免疫细胞在内的各种细胞类型向炎症部位的迁移中起着至关重要的作用。CXCL12由骨髓基质细胞、内皮细胞和真皮成纤维细胞产生。我们证明，与正常人皮肤相比，AD皮肤中波形蛋白+真皮成纤维细胞表达的CXCL12水平显著升高。有趣的是，T细胞也参与了AD皮肤中CXCL12的产生。AD的组织微环境中含有高水平的TSLP，可能影响皮肤中CXCL12的产生，TSLP治疗后24小时在皮肤成纤维细胞和T细胞中强烈诱导CXCL12，并且在我们的AD小鼠模型中持续升高。此外，体内影像学研究表明，在CXCL12的作用下，CXCR4⁺ NKT细胞在AD皮肤中富集并附着于CXCL12表达细胞，形成CXCR4⁺ NKT/CXCL12⁺细胞簇，这与先前的体内成像研究一致。此外，NKT细胞中CXCR4的条件性缺失显著减少NKT细胞浸润到我们的小鼠模型的发炎皮肤中，进一步支持CXCR4/CXCL12轴在AD皮肤驻留NKT细胞中的重要作用。近年来，在包括皮肤在内的非屏障组织和屏障组织中研究者们发现了不同表型的组织驻留记忆T细胞。皮肤中的T_RM在保护免疫免受感染方面起着重要作用，在慢性炎症性皮肤病（包括银屑病和AD）的发展中起着关键作用。这是首次确定表达CXCR4和CD69的皮肤NKT细胞是AD中T_RM的表型的研究。我们进一步证实了表达CXCR4的皮肤内NKT细胞是导致AD皮肤过敏性炎症发展的致病性T_RM。我们利用我们的AD模型，通过转移过敏原诱导的CXCR4⁺和CXCR-CD3⁺ NK1.1⁺NKT细胞以及TCRβ⁺ α-Galcer CD1d⁺ NKT细胞的实验证实了这一点。AD皮肤中CXCR4⁺ CD69⁺ NKT_RM细胞和CXCL12⁺细胞增多并形成簇，暗示抑制CXCR4/CXCL12可能是AD患者的一种治疗选择。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33516870/

----------微科盟更多推荐---------- 

免费生信作图平台——生科云
	长按左侧二维码  进入生科云
生科云所有分析工具可以免费使用，不收取任何直接或间接费用；您还可以在微信上联系微生态老师，随时获取免费的指导，帮助您解决分析时遇到的问题；专业的生信分析团队，持续添加、更新、优化生信云上的分析工具，集成多种生信分析流程，一键批量生成主流科研图，帮您节省时间，有更多的时间探究生物学意义。

----------微科盟精彩文章---------- 

如果需要原文pdf，请扫描以下二维码，加助理获取

蛋白组科研学术群期待与您交流更多蛋白组学科研问题

（联系蛋白组学老师即可申请入群）。

了解更多蛋白组学知识，请关注下列二维码。